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Nov 18, 2023

Nuovo massimo

Innovative laser scanning design unlocks high-precision

L'innovativo design della scansione laser consente osservazioni ad alta precisione fino a 10.000 fotogrammi al secondo, rendendo il microscopio un potente strumento di registrazione

SPIE-Società Internazionale di Ottica e Fotonica

immagine: Combinando due modalità di scansione laser, i ricercatori hanno sviluppato un versatile sistema di microscopia a due fotoni che può essere utilizzato per osservare processi biologici estremamente veloci con frame rate e risoluzione spaziale elevati.vedere di più

Credito: Li et al., doi 10.1117/1.NPh.10.2.025006.

La microscopia a due fotoni (TPM) ha rivoluzionato il campo della biologia consentendo ai ricercatori di osservare processi biologici complessi nei tessuti viventi ad alta risoluzione. A differenza delle tradizionali tecniche di microscopia a fluorescenza, il TPM utilizza fotoni a bassa energia per eccitare le molecole fluorescenti per l'osservazione. Ciò, a sua volta, consente di penetrare nel tessuto molto più in profondità e garantisce che le molecole fluorescenti, o fluorofori, non vengano danneggiate permanentemente dal laser di eccitazione.

Tuttavia, alcuni processi biologici sono semplicemente troppo veloci per essere registrati, anche con TPM all’avanguardia. Uno dei parametri di progettazione che limita le prestazioni di un TPM è la frequenza di scansione della linea, misurata in fotogrammi al secondo (FPS). Ciò si riferisce alla velocità con cui il campione target può essere spazzato dal laser di eccitazione lungo una direzione (ad esempio, in uno spostamento orizzontale). Una frequenza di scansione lenta influisce anche sull'FPS complessivo del sistema, poiché determina la velocità con cui il laser può essere spostato nella direzione opposta, ovvero in uno spostamento verticale. Insieme, questi creano un compromesso tra la risoluzione temporale del microscopio e la dimensione del quadro di osservazione.

Per aggirare questo problema, un team internazionale di ricercatori provenienti da Cina e Germania ha recentemente sviluppato una potente configurazione TPM con una frequenza di scansione della linea senza precedenti. Secondo il loro rapporto pubblicato su Neurophotonics, questo sistema di microscopia è stato progettato per l'imaging di processi biologici rapidi con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Uno dei fattori chiave che distinguono il TPM proposto da quelli convenzionali è l'uso di deflettori acusto-ottici (AOD) per controllare la scansione del laser di eccitazione. Un AOD è un tipo speciale di cristallo il cui indice di rifrazione può essere controllato con precisione dalle onde acustiche. Questo, a sua volta, ci consente di reindirizzare un raggio laser attraverso di esso come desiderato. Ancora più importante, gli AOD consentono una guida laser più rapida rispetto a quella ottenuta con i galvanometri utilizzati nei TPM convenzionali.

Di conseguenza, il team ha progettato un AOD personalizzato con una velocità acustica eccezionalmente elevata utilizzando un cristallo di biossido di tellurio (TeO2), ottenendo un'elevata frequenza di scansione della linea. Con questo AOD, il laser può scansionare una linea nel fotogramma in soli 2,5 microsecondi, corrispondente a una frequenza massima di scansione della linea di 400 kHz. Allo stesso modo, il team ha utilizzato un AOD per ottenere una frequenza di scansione lenta e ragionevole nell’altra direzione.

Per migliorare ulteriormente l'adattabilità del microscopio, il team ha aggiunto la possibilità di passare a un meccanismo di scansione laser basato su galvanometro, quando necessario. Ciò ha consentito la scansione di ampie regioni del campione con una risoluzione e una velocità accettabili, facilitando l'individuazione di piccole aree di interesse prima di passare alla scansione AOD.

Il team ha condotto diversi esperimenti di prova con il TPM di nuova concezione. Hanno installato finestre craniche su topi geneticamente modificati e le hanno usate per osservare la morfologia e l'attività dei neuroni, nonché il movimento dei singoli globuli rossi (RBC). Il sistema ha raggiunto un frame rate massimo di 10.000 FPS utilizzando una configurazione AOD e dimensioni del frame appropriate. Ciò è stato sufficiente per misurare con precisione la velocità con cui il calcio si propaga nei dendriti neuronali e per visualizzare la traiettoria dei singoli globuli rossi all'interno dei vasi sanguigni.

Impressionato da questi risultati, il Dr. Na Ji, redattore associato di Neurophotonics e Luis Alvarez Memorial Chair in Fisica Sperimentale presso l'UC Berkeley, osserva: "Il nuovo sistema per la microscopia a scansione basata su AOD rappresenta un miglioramento sostanziale nella velocità e nelle prestazioni dell'imaging, come dimostrato nella sua applicazione per la propagazione del segnale del calcio e la misurazione del flusso sanguigno nel cervello in vivo."